ЗАКОНОМІРНОСТІ ЗМІНИ АДСОРБЦІЙНОЇ РІВНОВАГИ БІОАКТИВНИХ З'ЄДНАНЬ
ЗАКОНОМІРНОСТІ ЗМІНИ АДСОРБЦІЙНОЇ РІВНОВАГИ БІОАКТИВНИХ З'ЄДНАНЬ
В даний час особлива увага приділяється розробці моделей адсорбції з розчинів наступних типів з'єднань:
- ті що слабо дисоціюють у водних розчинах органічні сполуки;
- прості іони;
- поліелектроліти;
- поверхнево-активні речовини.
Для кількісного опису адсорбції кожного з зазначених типів з'єднань
звичайно використовуються особливі підходи, розроблені для конкретних
систем. Оскільки більшість лікарських препаратів і біомолекул
відноситься до одному з приведених вище типів, то для них можна чекати
підпорядкування закономірностям при адсорбції з розчинів на поверхні
кремнеземів, виявлених для модельних з'єднань.
У вільну енергію адсорбції органічних молекул з низькою константою
дисоціації у воді основний внесок вносить дисперсійна взаємодія. Цей
процес може бути описаний за допомогою аддитивних схем розрахунку
внесків таких взаємодій на поверхні кремнезему. Закономірності
адсорбції простих іонів з водних розчинів на поверхні кремнезему були
також розглянуті вище. Значно ускладнюються адсорбційні рівноваги з
розчинів у випадку полімерів і поліелектролітів, до яких відносяться
білки, поверхнево-активні з'єднання, а також більшість лікарських
препаратів і біомолекул. При описі адсорбції поліелектролітів на
поверхні твердих тіл особлива увага приділяється різним
електростатичним взаємодіям між сегментами макромолекул і поверхнею, а
також латеральним взаємодіям між . адсорбованими макромолекулами і
можливими змінами їх конформацій при адсорбції. У випадку адсорбції ПАВ
при досягненні ними критичної концентрації мицеллоутворювання на
поверхні твердого тіла відбувається адсорбція як одиночних молекул, так
і мицелл. При цьому, якщо адсорбція поліелектролітів на поверхні
кремнеземів у більшості випадків описується рівняннями ізотерм,
подібними до рівнянь Генрі (в обмеженому діапазоні концентрацій
поліелектроліту в розчині), Ленгмюра,
Темкина ними Фрейндлиха, те ізотерми адсорбції багатьох ПАВ, обмірювані
в широкому діапазоні зміни їхніх концентрацій, мають двоступінчасту
форму з вираженими плато. Початкова частина ізотерми до першого плато
відповідає адсорбції одиночних молекул ПАВ, а наступна після цього
плато частина ізотерми описує адсорбцію мицеллярних агрегатів. Нижче
викладені деякі закономірності адсорбції поліелектролітів і
поверхнево-активних з'єднань на поверхнях вихідного і модифікованого
кремнеземів.
Значення Г і товщини адсорбованого шару полімерів на поверхнях
кремнеземів визначають іонна сила, рН розчину і природа іонів
індиферентного електроліту. Так, значення Г^ для поліакриламіду
знижується з підвищенням
концентрації солей LiCl, KC1 і CSC1, а товщина адсорбованого шару,
обмірювана методом эллипсометрии, при цьому значно зростає і виходить
на плато. Ступінь зниження Гя залежить від типу катіона електроліту, що
порозумівається конкурентною адсорбцією катіонів електроліту і полімеру
на поверхні кремнезему, що зростає в послідовності Cs+ > К+ > Li+
[25, 26].
Незважаючи на численні дослідження адсорбції різних білків на поверхні
твердих тіл, виконані за останні 20 років, їхнє адсорбційне поводження
ще не до кінця зрозуміло. Велике число робіт присвячене визначенню
природи і внеску різних процесів, що супроводжують адсорбцію білків.
Першою стадією адсорбції білків є транспорт молекул з розчину до
поверхні роздягнула фаз, і він може визначати загальну швидкість
процесу. Більш докладно кінетика адсорбції розглянута в наступних
розділах. При адсорбції білка на поверхні його молекула перетерплює
різні конформаційні й ориентаційні переходи, що приводять до зміни як
ємності адсорбованого монослоя, так і енергії взаємодії сегментів
молекули полімеру з центрами поверхні [27, 28]. При адсорбції білків на
поверхні кремнеземів з водних розчинів визначальними є гідрофільні і
гідрофобні характеристики молекул, що залежать від числа і структури
іонізованих і неіонізованих амінокислотних залишків. Тому що ступінь
гідратації при іонізації змінюється, гідрофільні властивості молекул
білка залежать від загального заряду глобули і рН водного розчину.
Заряд глобули білка при даному значенні рН можна оцінити,
використовуючи наступне рівняння:
6 + E[(6-6,)-(fl-fl,)].10^-S*>
1 + £10<"-2>'> ('U
де b, a - загальні кількості позитивних і негативних груп у молекулі
білка, здатних до іонізації; ЬІ , аі , - кількості груп кожного типу,
що іонізуються при даному рН розчину.
Властивості поверхні кремнезему ї його модифікацій впливають на стан
адсорбційної рівноваги й активність багатьох ферментів. Показано, що
значення Г^ альфа-амілази сильно .залежить від типу часток кремнезему і
зростає зі збільшенням ступеня гідрофобності поверхні при її
модифікуванні алкільними групами [29]. Більш сильна взаємодія з
гидрофобизированними кремнеземами приводить до значних змін конформації
адсорбованого ферменту
27
і до зниження його активності. Для усіх вивчених кремнеземів було
встановлене зменшення величини Гш при зростанні рН розчину і зниженні
температури. Мале значення спорідненості між ферментом і поверхнею
кремнезему (Кд) при цих умовах (високе рН і низька температура) зменшує
ступінь зміни конформації ферменту при адсорбції і викликає зростання
його відносної активності. Розгортання молекул адсорбованих ферментів
відбувається при більш низьких температурах, чим у розчинах. Ступінь
зменшення активності альфа-амілази при її адсорбції на поверхні
кремнезему тісно зв'язана зі зміною конформації молекули ферменту.
Прямі спостереження змін конформації ферменту методом циркулярного
дихроизма дозволили обґрунтувати механізм термічної дезактивації
ензимів при їхній адсорбції на поверхні кремнеземів [ЗО].
На прикладі адсорбції лужний протеази і грибної ліпази показано, що
визначальними процесами є електростатичну взаємодію між поверхневими
групами і молекулою ферменту, дегідратація гідрофобних ділянок і
латеральне відштовхування між адсорбованими молекулами ферменту [31,
32].
Адсорбція кислої фосфатази (М = 50 000) на поверхні силікагелю й
аэросила при рН 5,4 носить необоротний характер і описується рівнянням
Ленгмюра (5.3) [33, 34]. Велике значення ат = 5300 А2 пояснюють
розгортанням ланцюга гнучкої спіралі ферменту при його адсорбції на
поверхні кремнезему. Кількість десорбуючого ферменту після 1100 ч при
рН 5,4 складало менш 5 %, що вказує на необоротний характер адсорбції
ферменту, зв'язаний із сильною зміною конформації його молекули при
адсорбції.
Різні полісахариди і глікопротеіди є компонентами біомембран і
дослідження їхньої адсорбції з водних розчинів важливо для розуміння
механізму взаємодії кліток живих організмів із кремнеземами. Адсорбція
амілази з водних розчинів на поверхні силікагелю носить кінетичний
характер і рівновага в суспензії настає тільки після 120-170 ч [35].
Значення Гот досить
мало (0,02 мг/м ), тобто відповідає величині ат = 3,5 *10 А . Отримані
ізотерми адсорбції можна умовно розділити на 4 частині, що включають
прямолінійну початкову частину (до С = 0,006 мг/мл), S- образну другу
частину (від 0,006 до 0,07 мг/мл), лінійну частину ізотерми (від 0,08
до 0,20 мг/мл) і плато на цій ізотермі (від 0,2 до 0,5 мг/мол). Перша
частина ізотерми характерна для адсорбції лінійних полімерів на
поверхні твердого тіла. Основним механізмом у цій області є
многоточечна адсорбція довгих ланцюгів і заміщення коротких ланцюгів
полімеру більш довгими ланцюгами. Адсорбція має необоротний характер,
на що вказує тільки 5 % кількості десорбирующейся амілази при рН <
7,0. Передбачається, що конформація амілази в процесі адсорбції
змінюється від статистичного клубка в розчині *до розгорнутої спіралі
на поверхні кремнезему.
Результати дослідження адсорбції неионогенного ПАВ (Тритон Х-100) з
водних розчинів на поверхні пирогенного кремнозему показують, що
адсорбція підсилюється з підвищенням температури і додаванням солі в
розчин [36]. Вивчено також вплив добавок Тритон Х-100 на стабільність
водних суспензій
28
кремнезему. У діапазоні низьких концентрацій ПАВ стабільність суспензій
зменшується, при збільшенні змісту ПАВ проходить через мінімум і після
досягнення граничної концентрації мицелл в адсорбованому шарі знову
зростає. Добавки NaCl сприяють утворенню мицелл на поверхні і
викликають зниження стабільності суспензії.
Зміна поверхневого заряду часток аморфного кремнезему у водних
суспензіях у присутності катіонних ПАВ (хлориду алкилпиридиния і
броміду триметиламмония) було досліджено в залежності від рН суспензії
і концентрації солей [37]. Установлено двоступінчасту форму ізотерм
адсорбції цих ПАВ при низьких концентраціях солей у розчині. На першій
ступіні заряд поверхні змінюється відповідно до зміни кількості
адсорбируемого ПАВ, що свідчить про переважну взаємодію амонієвої групи
з поверхнею, на другий він росте дуже слабко з підвищенням концентрації
ПАВ на поверхні. Імовірно, це зв'язано з впливом углеводородного кінця
молекули ПАВ на зміну поверхневого заряду. Друга частина ізотерми
відповідає утворенню ассоциатов ПАВ на поверхні. При високій
концентрації солей початковий поверхневий заряд досить великий, слабко
залежить від концентрації ПАВ і поверхня стає менш гідрофобною.
Адсорбція длинноцепочечних четвертинних амонієвих солей з водних
розчинів на поверхні часток кремнезему описується ізотермою полислойной
адсорбції IV типу по класифікації Брунауэра [38], а з органічних
середовищ підкоряється рівнянню Ленгмюра. Знайдено, що значення ГА і
швидкості адсорбції ПАВ з водних розчинів значно вище, ніж при
адсорбції з органічних середовищ [39].
Адсорбція гідрохлориду кодеїну (метилморфина) з водних розчинів на
частках вихідного колоїдного кремнезему і поверхні кремнезему,
модифікованої октадецилдиметилсиланольними (ОДДМС) або
диметилсиланольними (ДМС) групами вивчена в присутності нейтральних
електролітів при різних рН розчину [40]. Катіони кодеїну сильно
взаємодіють з негативно зарядженою поверхнею кремнезему, однак такі
неорганічні солі, як NaCl або NaNO3, знижують ступінь адсорбції цього
катіона як на вихідної, так і на модифікованій поверхні кремнезему. На
поверхні кремнезему, модифікованої ОДДМС (заміщено тільки 10 %
поверхневих силанольних груп), катіони кодеїну адсорбируются в більшому
ступені при рН 6 у порівнянні з вихідним кремнеземом, тоді як при рН 8
значення Г х нижче в порівнянні з
вихідним кремнеземом. Адсорбція кодеїну сильно знижується на поверхні
кремнезему, цілком покритої ОДДМС-группами, однак підвищення
концентрації нейтральних солей у розчині при цьому викликає посилення
адсорбції.
Адсорбція цвиттер-ионного ПАВ (N-додецилбетаина (1ЧДБ)) з водних
розчинів на поверхні силікагелю була докладно вивчена в [41] із
застосуванням кінетичної флуорометрии, дифузійних і калориметричних
методів. Показано, що число агрегації мицелл 1ЧДБ залишається постійним
при зростанні концентрації ЫДБ або солей індиферентного електроліту в
розчині, але знижується при підвищенні температури експерименту.
Катіони й аніони цього
29
електроліту сильно взаємодіють з агрегатами мицелл НДБ. Ступінь
зв'язування іонів з агрегатами для СІ - іонів вище, ніж для Na+- і Са2+
- іонів. Зниження, що спостерігається, ендотермічних энтальпий
мицеллообразования з підвищенням температури або концентрації солей
зв'язано зі зміною структури ассоциатов молекул води навколо алкільних
груп НДБ.
Ізотерми адсорбції >ЩБ на поверхні силікагелю слабко залежать від
температури. Величина Гда залежить від концентрації солей і змінюється в
послідовності (СаС12 + ВДВ) > (NaCl + ВДВ) > ВДВ.
Екзотермічні диференціальні мольні энтальпии адсорбції змінюються
при варіюванні температури і концентрації солей аналогічно энтальпиям
мицелл ообразования. Показано, що значення Г п, отримані на підставі
різниці між початковою і
рівноважною концентраціями хондроитин - 6 - сульфата натрію або *
карбоксиметилцеллюлози на поверхні кремнезему Місоп FN з водних
розчинів, що містять 0,9 % NaCl, негативні в присутності поли( N -
винилпирролидона) [42]. Причиною такої негативної адсорбції може бути
агрегація часток кремнезему, що приводить до появи незаповненого
адсорбатами простору первинних і вторинних пір. Молекули води здатні
проникати в цей простір, тоді як молекули полімеру великого розміру в
нього не надходять, що приводить до їх концентрування в розчині.
5.4. КІНЕТИКА АДСОРБЦІЇ БIOАКТИВНИХ З'ЄДНАНЬ Адсорбція великих
біоактивних молекул на поверхні кремнеземів різної природи є кінетично
складним многостадійним процесом, що включає наступні стадії:
- транспорт молекул до границі роздягнула фаз адсорбент-розчин;
- процеси адсорбції-десорбції на границі роздягнула фаз;
- конформационні й ориентационні переходи молекул на границі розділу
фаз;
- о конкурентну адсорбцію молекул різної природи.
Початковою стадією процесу адсорбції є зовнішня дифузія адсорбата з
розчину до границі розділу фаз. У багатьох випадках ця стадія може
визначати швидкість сумарного процесу адсорбції. Наприклад, висока
початкова швидкість адсорбції протонированного порфиріна на негативно
зарядженій поверхні кремнезему контролюється зовнішньою дифузією [43].
Показано, що орієнтування молекул порфиріна в адсорбованому шарі в
першу чергу визначається стерическими умовами й електростатичною
взаємодією між адсорбованими молекулами, а не взаємодією між протилежно
зарядженими молекулами порфиріна і поверхнею. У присутності буфера, що
екранує латеральні взаємодії, молекули порфиріна більш-менш випадково
орієнтовані на поверхні при малому її заповненні, тоді як при високих
ступенях заповнення або під час відсутності фонового електроліту
спостерігається широкий розподіл орієнтації адсорбата із середнім кутом
45° між макроциклом порфиріна і поверхнею.
Початкова швидкість адсорбції таких сильних поліелектролітів, як
четвертинні поливинилпиридини і диметиламинометилметакрилат з водних
зо
розчинів на поверхні кремнезему звичайно визначається швидкістю їхнього
транспорту до поверхні і тому залежить від коефіцієнта дифузії цих
з'єднань, тобто їхніх розмірів [44]. Величина Гш у цих системах є
функцією внесків
різних типів взаємодій. Вони носять в основному електростатичний характер з істотним гідрофобним внеском.
Крім зовнішньої дифузії, швидкість процесу адсорбції може
контролюватися також внутрішньою дифузією речовини в порах адсорбенту.
Це явище звичайне спостерігається при адсорбції біоактивних з'єднань на
поверхні дрібнодисперсних кремнеземів, що володіють мікропористою
структурою, мезо- і макропористих силікагелів і аэрогелей. Явище
повільної внутрішньої дифузії широко використовується для готування
лікарських препаратів пролонгованої дії [45].
Гадана константа швидкості адсорбції (Кадс ) звичайно підкоряється законові зворотного опору:
L L J (5,12)
К К ТС
аде хим ^ диф
де Кхим - константа швидкості хімічної реакції на границі роздягнула
фаз; - константа швидкості дифузії адсорбата до границі роздягнула фаз.
При високій швидкості перемішування розчинів на поверхні непористих
твердих тіл кінетика адсорбції біополімерів лімітується хімічною
реакцією на границі роздягнула фаз рідин-тверде тіло. Природно, можливо
й існування змішаного механізму контролю кінетики адсорбції дифузією і
хімічною реакцією в діапазоні проміжних часів процесу [46].
Найбільше інтенсивно за останні 20 років вивчалася кінетика адсорбції
різних білків і ферментів з водних розчинів на поверхні вихідного і
модифікованого кремнеземів. Як уже відзначалося, розмір молекул
біополімерів значно перевищує середню площу реакційних центрів
поверхні, і звичайно відбувається необоротне многоточечне зв'язування
полімеру з великою кількістю поверхневих центрів. Тому застосування
класичних статистико-механічних моделей адсорбції, що зневажають
розмірами адсорбата, для опису адсорбції біополімерів некоректно.
Молекули адсорбата варто моделювати не крапкою, а геометричними
фігурами, що мають конкретні розміри (диски, стрижні, еліпсоїди
обертання, куби і паралелепіпеди). Велике поширення в останні роки для
опису кінетики адсорбції білків на поверхні твердих тіл одержала модель
так називаної випадкової послідовної необоротної адсорбції таких фігур
на плоску поверхню [47]. Основні постулати цієї моделі наступні:
- фігури розміщаються випадково в двомірНому просторі;
- якщо остання поміщена в цьому просторі фігура перекривалася з уже
присутньої на поверхні, то вона негайно віддаляється;
- залишаються на поверхні фігури жорстко фіксовані.
Розрахунок починається з порожньої плоскої поверхні і продовжується до
досягнення межі її насичення, коли вже неможливо розмістити на поверхні
наступні фігури, що моделюють молекули адсорбата. Ця модель застосовна
до
31
таких твердих білок, як фібриноген або альбумін, структура яких не
змінюється при адсорбції з розчину на поверхні. Білки моделювалися як
стрижні визначеної довжини, що можуть адсорбироваться в двох станах:
перпендикулярно і паралельно поверхні. Авторами встановлені залежності
загального і парціального заповнень поверхні стрижнями в цих
конфігураціях від часу, довжини стрижнів, а також від імовірностей
конфігурацій [48].
Звичайно зміни конформації полімеру при його адсорбції з розчину не
визначаються прямими методами, і про них судять по змінах товщини
адсорбованого шару або величинам Г^. Метод ИК-спектроскопии дозволяє
вивчити динамічне поводження при взаємодії сегментів молекули полімеру
з центрами поверхні твердого тіла. Так вивчена, наприклад, кінетика
адсорбції блок-сополимера полістирол (ПС) - полиэтиленоксид (ПЭО) на
поверхні часток •кремнезему [49]. Ідентифіковано три стадії процесу, що
розрізняються. У першій стадії полімер адсорбируется на вільних центрах
поверхні (Він-групи) і не піддається якому-небудь перегрупуванню.
Відносна частка центрів, зайнятих сегментами компонент сополимера (ПС і
ПЭО), обумовлена їх диференціальними энтальпиями взаємодії, а не
геометричними розмірами. В другій стадії процесу центри поверхні цілком
зайняті і чергові порції полімеру, що рухаються до границі роздягнула
фаз, шляхом перегрупування приєднуються у вже існуючому адсорбованому
шарі полімеру. Більш слабко зв'язані сегменти ПС заміщаються полярними
сегментами ПЭО зі свіжих порцій полімеру. В останній стадії процесу
відбувається повільна переугруповання в адсорбованому шарі полімеру.
Частка адсорбованих сегментів ПС знижується внаслідок додаткової
адсорбції сегментів ПЭО, і адсорбований шар сополимера здобуває щіткову
структуру.
Дослідження кінетики адсорбції яєчного альбуміну з лужних розчинів на
поверхні кремнезему при кімнатній температурі показало, що швидкість
адсорбції й удавана константа адсорбційної рівноваги зростають при
зниженні рН розчину [50]. Установлено значний вплив добавок
неорганічних солей, катіонну й аніонних ПАВ на кількість адсорбованого
білка і швидкість адсорбції. Початкова стадія процесу, як правило,
контролюється зовнішньою дифузією з обсягу розчину до границі
роздягнула фаз. Білки, що знаходяться в адсорбованому шарі, піддаються
різним ориентаціонним і конформаціонним переходам, що приводить до
зміни ємності монослоя і вільної енергії адсорбції. Показано, що навіть
необоротний зв'язані в адсорбованому шарі молекули білків у дійсності
піддаються різним процесам десорбції, обміну і заміщення іншими
компонентами розчину. Опоненти, що відстоюють модель оборотної
адсорбції білків на поверхні твердих тіл, думають, що просто необхідно
досить часу для повної десорбції білка в буферний розчин.
У літературі описані теорії адсорбції білків, що базуються на апараті
термодинаміки оборотної адсорбції, наприклад у роботі [51]. Однак
отримані до дійсного часу експериментальні дані, що включають коливання
концентрацій білків в адсорбованому шарі, не можуть бути пояснені на
підставі якого-небудь термодинамічного рівняння стану. Це, очевидно,
зв'язане з тим, що в діапазоні часів експериментального спостереження
адсорбції деякі стадії процесу,
32
лимитуючі кінетику, залишаються непоміченими. Більш підходящими
підходами до моделювання процесу адсорбції білків, таким чином, можуть
бути різні моделі, що описують кінетику адсорбції в цих складних
системах. Опис реальних процесів адсорбції вимагає значного ускладнення
кінетичних моделей. Моделювання повинне включати процеси дифузії,
конвекції, ориентаціонних і конформаціонних переходів молекули білка в
адсорбованому шарі, десорбцію і заміщення на можливі компоненти
розчину, а також латеральні взаємодії між адсорбованими молекулами.
Показано, що адсорбція гемоглобіну з водних розчинів при рН < 8,0 на
поверхні силікагелю носить необоротний характер [52]. Кінетика цього
процесу описується рівнянням другого порядку:
■JS—Ч (5.13)
Г )
Це рівняння формальне відповідає ленгмюровской кінетиці адсорбції, що
описує швидкість одноцентрової локалізованої адсорбції на неоднорідній
поверхні під час відсутності латеральної взаємодії між адсорбованими
молекулами. Установлено, що значення К*™ знижується від 0,110 до 0,034
л/моль * с) при зростанні рН розчину від 4,2 до 6,2. Значення жГя при
цьому
зміні рН залишається постійним (ЗО мг/200 мг силікагелю). При рН 8
адсорбція білка визначається цілком контактами гідрофобних ділянок
молекули білка і поверхні.
Спроба опису кінетики адсорбції кислої фосфатази на поверхні
макропористого силікагелю при рН 5,0 у линеаризованних координатах
інтегральної форми рівняння (5.13) привела до одержання двох прямих з
різними кутами нахилу [53]. Роздільно визначені параметри Гж і К^м
двох
стадій адсорбційного процесу. Вони виявилися рівними відповідно (TJi =
50 мкг/м2, (КхиМ)і = 190 л /(моль * с) і (Гоо)2 = 83 мкг/м2, (К,^^ =
9,3 л/(моль * с). Установлено, що величини (Гда)і і (К^м) при зменшенні
розміру гранул
силікагелю зростають. Припускали, що початкова частина кінетичної
ізотерми відповідає зовнішньої дифузії, а інша порозумівається
внутрішньою дифузією в порах силікагелю. Знайдено також, що швидкість
адсорбції ферменту на поверхні силікагелю зростає в 50 разів після
модифікування поверхні кремнезему шляхом попередньої адсорбції лецитіна.
Кінетика адсорбції кислої фосфатази (М = 50 000), ацилази (М = = 87
000) і гемоглобіну (М = 67 000) на поверхні макропористого силікагелю й
аэросила більш докладно вивчена в [54]. Висновок про дифузії, що
лімітує швидкість процесу, зроблено на підставі зростання початкової
швидкості адсорбції кислої фосфатази на силікагелі при зменшенні
розміру його гранул і при переході до високодисперсного аэросилу, а
також з обліком того, що швидкість не залежить від температури в межах
4-40 °С. Аналогічні закономірності спостерігалися також і для кинетики
адсорбції ацилази і гемоглобіну на поверхні силікагелю. Відносна
швидкість адсорбції білків зростає зі збільшенням їхньої молекулярної
маси в ряді: ацилаза > гемоглобін > кисла фосфатаза.
33
Допускається, що швидкість адсорбції лімітується асоціацією білків в адсорбційному шарі.
Для опису кінетики адсорбції білків з розчинів на поверхні твердих тіл
широко використовується наступне емпіричне рівняння, відоме в кінетиці
хемосорбції як рівняння Еловича:
r/Tn.=a + blgt (5.14)
Наприклад, кінетика адсорбції гексокинази (Co = 0,4 мг/мл) на поверхні
силікагелю (0,1 г) у 0,05 М имидазольном буфері при рН 6,2 добре
описується рівнянням (5.14) з параметрами а = 0,24-0,35 і Ь= 0,37-0,39
[55]. Адсорбований шар білка, що утвориться, залишається стабільним при
рН < 7,0, тоді як при рН > 7,0 швидкість десорбції білка зростає
зі збільшенням рН розчинів. Якщо взаємодія білка з поверхнею кремнезему
здійснюється головним чином за рахунок електростатичної взаємодії між
групами поверхні й іонізованих амінокислотних залишків молекул білка,
то визначена конформація білка (статистичний клубок) стабілізована в
розчині за рахунок електростатичного притягання між полярними групами
молекул білка. Таким чином, тільки частина цих груп може спочатку
взаємодіяти з полярними групами поверхні. Однак у процесі адсорбції
клубок білка розвертається, що і дозволяє іншим його полярним групам
взаємодіяти з центрами поверхні. Тому параметр b у рівнянні (5.14)
залежить від енергії активації переходу структури білка від
статистичного клубка в розчині до розгорнутої спіралі при його
адсорбції на поверхні і від зміни при цьому переході площі проекції
молекули білка, доступної для її взаємодії з центрами поверхні твердого
тіла.
З представленого матеріалу випливає, що на відміну від адсорбції
простих речовин з газової фази швидкість і стан рівноваги процесів
адсорбції біоактивних з'єднань з водних розчинів на поверхні
кремнеземів сильно залежать від таких параметрів, як температура, час,
інтенсивність перемішування розчину, концентрація адсорбата, іонна сила
розчину, добавки поверхнево-активних з'єднань, рН розчину, природа
іонів індиферентного електроліту, структура кремнезему і хімічна
природа його модифікованої поверхні. Це, з одного боку, дає для
практиків можливість досить широкого варіювання умов адсорбції різних
лікарських препаратів, біомолекул на поверхні кремнеземів і його
похідних, а з іншого боку - надзвичайно утрудняє можливість детального
дослідження цих процесів.
У більшості випадків адсорбція лікарських препаратів і біомолекул
великого розміру, особливо біополімерів, з водних розчинів на поверхні
вихідних і модифікованих кремнеземів пористої структури протікає
необоротно і здійснюється тривалий час. Це зв'язано з багатоцентровим
характером їхньої адсорбції і змінами структури молекул "навіть на
стадії активованої дифузії в пори. Десорбцію цих з'єднань з поверхні,
як правило, удається провести тільки при зміні умов експерименту (рН і
іонна сила розчину, добавки органічних розчинників). Оскільки
ефективність багатьох лікарських препаратів пролонгованої дії заснована
на повільній десорбції препаратів з поверхні в обсяг розчину, те часто
необхідно збільшувати її швидкість (знижувати енергію активації),
наприклад за рахунок зменшення внеску найбільш сильної
34
електростатичної взаємодії. Останнє досягається шляхом попередньої часткової або повної гідрофобізації поверхні.
Цих недоліків позбавлений високодисперсний аморфний непористий двооксид кремнію - силикс.
ТОКСИКОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ СИЛИКСА
Уже давно високодисперсний кремнезем (ВДК) дозволений для медичного
застосування як-допоміжна речовина при виготовленні багатьох лікарських
форм. При цьому зміст його в останніх не повинно перевищувати 8-16 %
[1]. Особливо широко при виготовленні лікарських препаратів
використовує ВДК фірма "Новартис", утворена шляхом злиття двох
провідних фармацевтичних компаній - "Сиба-Гейги" і "Сандоз". У багатьох
країнах ВДК і його похідні використовуються як харчові добавки, а також
матриць для створення лікарських форм із заданими властивостями. Таким
чином, ці речовини добре відомі у фармації. Проте дослідження
останнього років виявили багатообіцяючі для практичної медицини
сорбционні властивості ВДК у дозах, що трохи перевищують раніше
дозволені, що зажадало проведення додаткових медико-біологічних
досліджень його нешкідливості.
Створені на основі ВДК із питомою поверхнею 300 м2/м препарати
медичного призначення одержали назви: силикс (синонім - силлард) - для
аплікаційного, місцевого застосування; силикс МП (медичний пероральний,
синонім - силлард П) - для прийому per os у якості энтеросорбента. Обоє
зазначених препарату ідентичні по хімічному складі і фізико-хімічних
властивостях, обоє стерильні. Відрізняються вони тільки упакуванням.
Надалі ми використовували загальну назву препаратів - "силикс".
A priori передбачалося, що будь-який сорбент повинний поводитися в
кишечнику як відносно інертний матеріал, але даної літератури
останнього років свідчать про зворотний і це відноситься навіть до
природних харчових волокон, вплив яких на організм досліджено
найбільшою мірою . З'ясувалося, що їхнє застосування помітне змінює
стан травного тракту тварин. Так, відрубай, пектин, гуаровая смола й
інші речовини змінюють стан химуса, швидкість його пасажу, а в ряді
випадків і рН у просвіті кишечнику [2, 3].
Сорбенти впливають також і на стан стінки кишечнику, у першу чергу його
слизуватої оболонки. Тривалий прийом целюлози зменшує довжину тонкої
кишки, а гуаровой камеді - збільшує [4, 5]. Харчові волокна можуть
35
стимулювати ріст эпителиоцитов кишечнику, збільшуючи площу поверхні слизуватої, або робити "абразивний" ефект [6].
Більшість энтеросорбентов стимулює кишкову моторику, але деякі з них
сповільнюють транзит їжі, викликаючи в пацієнтів затримку стільця
(полифепан) або запори (вугільні сорбенти) [7, 8]. Дослідження
слизуватої кишечнику у тварин, що одержували полифепан у дозі 1 г/кг,
виявило впровадження часток сорбенту в міжклітинний простір і
лімфатичні капіляри, адсорбцію часток на мікроворсинах [7].
Багато хто энтеросорбенти впливають на процеси травлення, усмоктування
і секреції. Так, гуарові волокна в терапевтичній дозі гнітять секрецію
глюкагона підшлунковою залозою і підвищують абсорбцію кальцію [9, 10].
Целюлоза підвищує активність дисахариду, а сапоніни гнітять «активність
лактази, але підвищують активність альфа-амілази [11]. Хітинові
сорбенти здатні модулювати активність цілого ряду ферментів - ліпази,
амілази, глюкокинази і простагландинсинтетази [12]. Энтеросорбенти
впливають і на кишкову мікрофлору, регулюючи її ріст як за рахунок
сорбції мікроорганізмів, так і за допомогою зміни середовища їх
населення [6]. При энтеросорбции може порушуватися усмоктування
мікроелементів і вітамінів - ступінь цієї дії визначається видом
сорбенту, тривалістю їхнього прийому і дозою [7, 13].
Нижче приводяться дані вивчення токсичності силикса при його энте-ральном уведенні.
9.1. ДОСЛІДЖЕННЯ ТОКСИЧНОСТІ СИЛИКСА
Відповідно до вимог, пропонованими до знову розроблювальних лікарських
засобів, на різних видах тварин досліджена токсичність силикса в
гострому і хронічному експерименті.
Гостра токсичність силикса. Дослідження проводили на двох видах тварин
- пацюках і кроликах. Виявилося, що препарат при пероральному його
введенні в дозі до 10 г/кг нетоксичний, а в дозах 20 і 40 г/кг викликає
загибель окремих тварин унаслідок розривів шлунка або обтурационний
непрохідності.
Роздільно на самцях і самках пацюків при однократному введенні
препарату в дозі 10 г/кг досліджений вплив на деякі показники крові й
обміну речовин. У пацюків-самців сорбент викликав відхилення тільки в
першу добу після введення. Зростав рівень глюкози в крові (з 4,2 ± 0,3
до 5,6 ±0,1 ммоль/л), сироваткового холестерину (з 1,6±0,1 до 2,1±0,1
ммоль/л), сироваткових хлоридів і неорганічного фосфату (відповідно з
90,7 ± 4,5 і 0,7 ± 0,13 до 115,6 ±3,3 і 1,0 ±0,12 ммоль/л). Однак уже
через 3 діб ці показники нормалізувалися й у більш пізній термін (7 і
40 діб) не відрізнялися від контролю. Відхилень інших досліджених
показників (сечовини, креатинина, білірубіна, загального білка,
гемоглобіну й ін.) не було .відзначено в жодному з термінів
спостереження.
Самки виявилися трохи більш чуттєвими до дії силикса - і через 10 діб
після введення препарату в дозі 10 г/кг виявлялося зниження кількості
лейкоцитів (з (11,0 ± 0,5) о 109 до (8,7 ± 0,6) : 109 л"1). У сироватці
крові трохи зростав рівень сечовини, креатинина і білірубіна
(відповідно до 9,4 ± 0,6, 102 ±
36
6 і 22,4 ± 4,0 при 6,0 ± 0,6 ммоль/л, 88 ± 6 і 8,7 ± 2,0 мкмоль/л у
контролі). Однак через 20 і 40 діб ці показники не відрізнялися від
контрольних величин.
Вивчався також вплив однократного введення силикса в дозі 10 г/кг на
деякі фізіологічні показники. Препарат не впливав на динаміку приросту
маси пацюків. Так, за 40 діб спостереження маса самців у контролі
зросла з 199 ±6, до 266 ± 8 м, а в досвідченій групі - з 198 ± 4 до 260
± 6 р. Не відрізнялася і динаміка приросту маси пацюків-самок. Уведення
силикса не змінювало біоелектричну активність серця. Тільки через 1 ч
послу введення 10 г/кг силикса знижувалася тривалість комплексу QRS (з
0,036 ± 0,003 до 0,021 ± 0,001 с). В інші терміни експерименту
параметри ЭКГ не відрізнялися від контролю. Уведення препарату в дозі
10 г/кг істотно не змінювало ректальну температуру пацюків.
Відзначалося швидкоминаюче зниження болючої чутливості - останню
визначали за методикою Сперанского, використовуючи імпульсний струм
частої 5 Гц і тривалістю 5 мс. Таким чином, уведення силикса в дозі 10
г/кг однократно не викликало істотних змін фізіологічного стану пацюків.
Проводилося також дослідження впливу силикса в дозах, близьких до
передбачуваним лікувального. Для цього пацюкам вводили однократно 100,
330 і 1000 мг/кг силикса й у різний термін проводили дослідження. Через
24 ч послу його введення в пацюків-самців, що одержали 1000 мг/кг
препарату, трохи зростав зміст у крові глюкози, помірковано
підвищувався рівень сироваткових хлоридів і холестерину. У дозі 330
мг/кг силикс трохи підвищував тільки зміст холестерину, а в дозі 100
мг/кг не викликав яких-небудь змін. Аналогічним була дія силикса і на
пацюків-самок. Через 7 діб після однократного введення силикса в жодній
із груп не виявлялися зміни з боку вивчених показників (клітинний склад
крові, час згортання крові, рівень глюкози, загального білка,
холестерину, хлоридів, активності лужної фосфатази й інших параметрів).
Дослідження гострої токсичності силикса на кроликах у дозах,
аналогічних використаним на пацюках, не виявило видових розходжень у
дії препарату. Уведення силикса в дозі 500 мг/кг у виді 5 %-й водної
суспензії интактним пацюкам усередину шлунково протягом 10 діб не
впливало на активність у сироватці крові аланинаминотрансферази й
аспартатаминотрансферази, ферментів антиоксидантной системи еритроцитів
(глутатионпероксидази, супероксиддисмутази і каталази), на зміст
вітаміну Е в сироватці крові, селен, алюмінію, магнію, міді і цинку в
печінці, але приводило до деякого зниження рівня вітаміну А в крові, а
заліза і марганцю - у печінці [14].
Токсичність силикса при багаторазовому введенні. Дослідження
проводилися на пацюках, кроликах .і свинях. Протягом усього періоду
спостереження (6 мес) силикс при пероральному введенні в дозах 100, 330
і 1000 мг/кг не викликав видимих відхилень у загальному стані тварин
або їхньому поводженні. Зовнішній вигляд, споживання води і їжі не
відрізнялися від таких у контролі.
Тривале введення препарату не робило дії на динаміку приросту маси
тварин, болючу чутливість пацюків, не викликало відхилень у
біоелектричній
37
активності серця пацюків. Тільки в дозі 1000 мг/кг (експозиція 1 мес)
виявлене невелике уповільнення внутрісерцевої провідності. Силикс
істотно не впливає і на функцію бруньок, про яку судили по величині
добового діурезу. Однак одномісячне введення препарату в дозі 1000
мг/кг викликало короткочасне підвищення змісту білка в сечі. При
подальшому збільшенні тривалості введення силикса до 2, 3 і 6 мес ці
показники нормалізувалися. Така ж доза препарату (1000 мг/кг) викликала
короткочасне підвищення рівня сечовини в сироватці крові тварин. При
мікроскопічному дослідженні осаду сечі в пацюків, що одержували силикс,
не виявлені патологічних відхилень. Аналіз сечі на глюкозу, кетонові
тіла, кров дав негативні результати.
Силикс у дозі 100 і 330 мг/кг істотно не впливає на экскрецию із сечею
пацюків 17-кетостероидов. Тільки в дозі 1000 мг/кг у початковий термін
•досвіду (1-2 мес) препарат трохи знижував экскрецию 17-кетостероидов із
сечею. У наступному (3-6 мес) і після припинення введення силикса змін у
экскреции 17-кетостероидов не спостерігалося.
Вплив силикса на гематологічні показники. Уведення силикса у
вищевказаних дозах протягом 20 діб не викликало статистично значимих
змін змісту гемоглобіну і клітинного складу периферичної крові пацюків.
Відзначалася тільки тенденція до уповільнення згортання крові у тварин
що о