ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
Наиболее распространенными материалами для выявления хламидий являются мазки-соскобы из уретры и цервикального канала у женщин и из уретры у мужчин. Однако в настоящее время исследуются и другие материалы, такие как первая порция мочи, отделяемое влагалища и др.
При исследовании материалов из уретры уретральный тампон вводится на 1,5-2 см в уретру женщины и на 3^ см в уретру мужчины. Тампон осторожно вращается в уретре в течение 5-10 сек.
Материал из канала шейки матки берется в зеркалах. Необходимо тщательно очистить наружную часть шейки матки, используя пинцет с марлей или большой ватный тампон, чтобы удалить наружные выделения.
Затем в цервикальный канал на 2 см вводится щеточка или тампон для взятия образца и вращается в течение 10 сек, для того чтобы получить соскоб эпителиальных клеток. Тампон осторожно вынимается, при этом не следует касаться поверхностей стенки влагалища.
У мужчин при использовании метода ПЦР возможно исследование первой порции свободно выпущенной мочи. Обычно берется 5-10 мл мочи в специальную стерильную пробирку. У женщин исследование мочи не рекомендуется.
При использовании метода ПЦР возможно взятие материала из влагалища
специальным тампоном.
У новорожденных детей материал берется из носоглотки, из гортани и из конъюнктивы. Специальный назофарингеальный тампон вводится через носовые ходы до стенки глотки. Из гортани или задней стенки глотки материал берется специальным (можно уретральным) тампоном.
Для взятия материала с конъюнктивы нижнего века используется тонкий
(уретральный) тампон, которым берутся эпителиальные клетки.
МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ХЛАМИДИОЗОВ
В недавнем прошлом вполне достаточными считались простые цитоскопические методы диагностики хламидиоза, т. е. просмотр мазков-препаратов из пораженных тканей, окрашенных по Романовскому — Гимзе или Маккиавелло. Обнаружение внутриклеточных включений говорило о хламидийной этиологии поражений.
Цитологические методы обладают низкой чувствительностью, способны
дать положительный результат лишь в 10 случаях из 100 пораженных, т.е. отсутствие телец Гальберштедтера — Провачека не исключает наличия хламидийной инфекции. Не имеет преимуществ и метод окраски препаратов по Папаниколау, т. к. дает много ложноположительных результатов.
ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ (ИММУНОЦИТОСКОПИЧЕСКИЕ) МЕТОДЫ
Эти методы основаны на обнаружении антигенных субстанций с помощью специфических антител, соединенных с какой-либо меткой (флюоресцирующей, ферментной, радиометкой). Наиболее распространены прямой и непрямой иммунофлюоресцентные методы — ПИФ и НИФ. Их чувствительность составляет 90-100%, специфичность при исследовании препаратов из урогенитального тракта — 85-100%). Однако применение ПИФ и НИФ требует правильной оценки результатов, т. к. флюоресцировать может зернистость в лейкоцитах.
Для взятия материала используются специальные щеточки или дакроновые тампоны. Для качественного окрашивания препаратов необходимо использовать специальные стекла для иммунофлюоресценции с лункой в середине стекла. Следует особо обратить внимание на то, что при нанесении материала тампон или щеточка должны прокатываться по стеклу. Препарат должен быть доставлен в лабораторию в день взятия материала.
В случае необходимости фиксированные в течение 1-2 минут холодным
ацетоном препараты можно хранить в бытовом холодильнике в течение 3 дней.
Последовательность операций при использовании иммунофлюоресцентных методов следующая. Препарат-мазок фиксируют охлажденным ацетоном. Затем на него наносят меченую сыворотку или моноклональные меченые антитела и помещают его во влажную камеру в термостат на 15 мин. Для контрастирования на препарат наносят бычий альбумин, меченный родамином, или синьку Эванса. Современные наборы с моноклональными антителами содержат в своем составе синьку Эванса. После 15-минутной инкубации стекла интенсивно промывают фосфатно-солевым буфером рН 7,2 или проточной водой. На высушенные мазки
наносят 1 каплю забуференного глицерина (9 мл глицерина и 1 мл фосфатно-солевого буфера), накрывают покровным стеклом и прижимают фильтровальной бумагой, чтобы удалить избыток жидкости. Препараты просматривают в люминесцентном микроскопе «ЛЮМАМ» (светофильтры БС 8-2, СЗС 14-4, ФС 1-2, объектив х90, окуляры хЮ, собственное увеличение бинокулярной насадки xl,5) или люминесцентном микроскопе других моделей с использованием объективов х20, х40, хЮО.
Учет результатов проводят по наличию элементарных телец в поле зрения или в препарате (более 5), флюоресцирующих ярко-зеленым (яблочно- зеленым) цветом на фоне эпителиальных клеток, окрашенных в оранжевый или красный цвет. Результат анализа выдается обычно на следующий день. Рекомендуются
следующие варианты ответа: «Методом ПИФ обнаружены Chlamydia trachomatis», «Методом ПИФ Chlamydia trachomatis не обнаружены», «Рекомендуется исследование повторить (из-за отсутствия клеток в препарате или неспецифической флюоресценции)».
Иммунопероксидазный метод диагностики имеет сходство с им- мунофлюоресцентным. В качестве маркера используется фермент пероксидаза. Выявление комплекса «антиген — антитело — пероксидаза» достигается гистохимической реакцией на пероксидазу с субстратом-индикатором З-З'-диаминобензидинтетрагидрохлоридом — ДАБ. Продукт реакции окрашивается в коричневый цвет, что позволяет выявить локализацию антигена внутри клетки. Чувствительность и специфичность метода возросли после введения в практику моноклональных антител и составили соответственно 100% и 92,4%.
Иммуноферментнмй анализ
Данный метод основан на обнаружении растворимого антигена хламидий в исследуемой пробе. Тест представляет собой метод твердофазного иммуноферментного анализа. Клинический материал берут тампоном в специальные транспортные пробирки, которые поставляются производителями наборов, и доставляют в лабораторию в течение 48 часов на холоде. Перед транспортировкой хранят при 4-6 С. До исследования образцы нельзя замораживать.
Постановку реакции следует осуществлять строго по предложенной фирмой инструкции. После проведения всех манипуляций учитывают результат.
Положительные пробы окрашиваются в желто-оранжевый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антигена С. trachomatis, абсорбированного на шарике или в ячейке панели. Точный результат определяют с помощью спектрофотометра «Мультискан» или другого аппарата, предназначенного для этих целей, при длине волны 492 нм. Образцы, дающие значение поглощения выше или равное значению отсекающего поглощения (cut-ofi), считаются положительными, т. е. они говорят о наличии антигена С. trachomatis в исследуемой пробе. Чувствительность и специфичность иммуноферментных методов диагностики составляет соответственно 65-70% и 90-100%.
Результат исследования выдается через 1-3 дня. Варианты ответа: «Методом ИФА обнаружены С. trachomatis», «Методом ИФА С. trachomatis не обнаружены».
ВЫДЕЛЕНИЕ ХЛАМИДИЙ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
Для взятия материала используются специально предназначенные тампоны — отдельно для уретры и цервикального канала. Материал помещается в пробирку с транспортной средой. Пробирки и среды, не предназначенные для транспортировки образцов, могут быть токсичными для клеток, а это может привести к ложноотрицательному результату. Транспортную среду можно хранить при комнатной температуре 1 день, при 4 С месяц, при -20 С — 4 месяца. Взятый материал следует сохранять при 4-6 С и в течение 24 часов
направить в лабораторию, обложив пробы льдом. Исследование требует
сохранения живых хламидий, поэтому важно соблюдать температурный
режим доставки материала.
Используются клеточные линии McCoy, L-929, HeLa-920. Линии клеток пересевают обычно через 5-7 дней, на 3^1 сутки меняют среду. Клетки со стекла снимают раствором версена или трипсина (0,02% и 0,25% соответственно). Суспензию клеток для выращивания монослоя на покровном стекле готовят густотой 2,0x10 и вносят ее в плоскодонные пробирки с помещенным на дно покровным стеклом. Можно применять для этой цели пластиковые микропанели с плоскодонными лунками. Монослой формируют в вертикальном положении пробирок при 37 С в течение 24 часов.
После удаления питательной среды выращенные клетки заражают инфекционным материалом из транспортной среды в объеме 0,5 мл и центрифугируют в центрифуге с горизонтальным ротором при 2500 об./мин в течение 1 часа. После этого инокулят удаляют, в пробирки или лунки вносят поддерживающую среду 199 с 5% сыворотки крупного рогатого скота или сыворотки плодов коров, 5% р-ра глюкозы, 0,9-1,0 мкг/мл циклогексимида, а также антибиотики (100 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ванкомицина и 25 мкг/мл амфотерицина В).
Через 48 часов после заражения покровные стекла с монослоем извлекают
из пробирок, подсушивают на воздухе и фиксируют в холодном ацетоне. Дальнейшие действия полностью соответствуют обработке препаратов
для ПИФ.
Просмотр препаратов в люминесцентном микроскопе дает возможность
увидеть ярко-зеленые внутриклеточные микроколонии хламидий
на оранжевом фоне цитоплазмы. При малом количестве ЭТ в исследуемом материале срок инкубации зараженных культур увеличивают до 3-5 дней, в некоторых случаях производят пассажи, т. е. заражение свежих культур жидкой фазой и клетками
первичной культуры. Диагностические лаборатории редко используют
пассажи из-за чрезмерного затягивания в выдаче ответа.
Метод выделения С. trachomatis в культурах клеток высоко чувствителен
и специфичен, только он позволяет обнаружить жизнеспособных
возбудителей. Однако и этот метод в 10-15% случаев может дать ложно-
отрицательный ответ.
Результат анализа выдается через 5-7 дней. Варианты выдачи ответа
при культуральной диагностике: «Культуральным методом выделены
С. trachomatis», «Культуральным методом С. trachomatis не выделены»,
«Исследование повторить из-за цитопатического действия».
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Основаны на определении специфичных для С. trachomatis последовательностей
ДНК или РНК.
Существуют неамплификационные методы молекулярной диагностики.
К их числу относят гибридизацию ДНК in situ, гибридизацию на
фильтре и дот-блот гибридизацию. Методы позволяют выявить искомые
нуклеиновые кислоты в 85-90% случаев.
Новыми приемами ДНК-диагностики являются амплификационные
методы, позволяющие путем многократного копирования (амплификации)
искомых участков ДНК при участии фермента термостабильной по-
лимеразы получить накопление чрезвычайно большого количества искомых
участков ДНК — ампликонов. Метод называют полимеразной цепной
реакцией (ПЦР), его чувствительность близка к 100%. Ограничения в
применении метода заключаются в необходимости строгого соблюдения
технологии, т.к. может иметь место амплификация ничтожных количеств
ДНК, занесенных с пипеток, некоторых деталей оборудования. Это относится
и к другому диагностическому ДНК-методу — лигазной цепной реакции,
хотя в последней учет результатов осуществляют не в электрофорезе
ампликонов, а с помощью иммунохимической реакции.
Большое внимание привлекают амплификационные методы, в которых
амплифицируется сигнал, а не участок ДНК. Примером аппаратуры,
применяемой для этой реакции, является Digene Hybride Cupture System
II, представляющая собой автоматизированную систему, способную выдать
ответ на исследуемую пробу в течение одного рабочего дня. В реакции
гибридизируется РНК-зонд с ДНК образца. К сожалению, большая
стоимость самой системы и реактивов к ней ограничивает ее использование
лишь редкими диагностическими лабораториями.
Для взятия материалов и использования ПЦР-анализа используются
тампоны и специальные транспортные пробирки, которые получают в лаборатории.
Образцы с тампонами могут храниться максимально в течение
3 дней до отправки в лабораторию при 4-6 С, а образцы мочи должны
быть доставлены в лабораторию не позднее 24 часов после сбора. При
необходимости эти образцы могут храниться в течение месяца при -20 С.
Постановка реакции проводится строго в соответствии с рекомендациями
фирмы-изготовителя наборов и с соблюдением всех мер предосторожности
для исключения перекрестной контаминации.
Результат выдается через 1-3 дня. Варианты ответа: «Методом ПЦР
обнаружены С. trachomatis», «Методом ПЦР С. trachomatis не обнаружены
».
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Ранее применявшиеся реакция связывания комплемента и реакция
пассивной гемагглютинации в настоящее время почти забыты. Более распространена
реакция микроиммунофлюоресценции (рМИФ). Технически
она трудоемка, т. к. основана на использовании непрямого варианта им-
мунофлюоресценции. Для ее постановки на предметное стекло наносят
ряд капель, содержащих ЭТ хламидий из культуры в желточных мешках
куриных эмбрионов. Препарат высушивают и на каждую из капель ЭТ
наносят разведения исследуемой сыворотки (от 1:8 до 1:1024). Далее после
отмывки не связавшихся антител наносят меченную ФИТЦ антигло-
булиновую сыворотку против белков сыворотки человека. Последующий
ход исследования обычен для реакций иммунофлюоресценции, учет в
люминесцентном микроскопе по предельному разведению сыворотки,
дающему люминесценцию ЭТ.
В настоящее время широко используются иммуноферментные методы
выявления антител к С. trachomatis с дифференцировкой иммуноглобулинов
G, М, А. В качестве антигенов используются рекомбинантные
липополисахариды.
Серологические методы помогают в ряде случаев определить стадию
и характер течения заболевания. Это особенно важно при восходящей
и персистирующей инфекции, которая поддерживает хроническое
течение болезни на протяжении нескольких месяцев и даже лет и тем самым
повреждает или разрушает ткани и органы.
В основе данных методов лежит выявление специфических антител,
которые накапливаются в сыворотке крови и в секретах инфицированного
органа в ответ на внедрение возбудителя. Антитела относятся к трем
классам иммуноглобулиновых молекул: М, А и С Накопление антител
каждого из этих классов происходит через разные промежутки времени,
что зависит от характера инфицирования (первичное или повторное). При
первичном инфицировании сначала появляются антитела класса М, затем
— в и в последнюю очередь — А. По мере угасания иммунного ответа
снижение концентрации титра антител каждого класса происходит в
той же последовательности. Иммунный ответ при повторном проникновении
возбудителя характеризуется быстрым нарастанием титра антител
б и А и практически полным отсутствием антител класса М.
Таким образом, при остром инфекционном процессе у пациентов
можно обнаружить антитела класса М или быстро нарастающие количества
антител классов в и А. Напротив, при хронически протекающих заболеваниях
выявляются специфические антитела классов О и А, концентрации
которых не изменяются на протяжении длительного периода.
В ряде случаев (в 3%) при хронически протекающих заболеваниях, прежде
чем образуются антитела класса в, в течение нескольких недель регистрируются
невысокие титры антител класса А (<1/8). При бессимптомном
течении заболевания определение антител класса А в постоянно низких
титрах на протяжении многих недель говорит о микробной перси-
стенции. Низкие (<1/64), не меняющиеся во времени титры специфических
антител класса в указывают на давно перенесенную хламидийную
инфекцию. При острых формах заболевания диагностическое значение
имеет обнаружение хламидийных ^М, 1§А антител либо установление
сероконверсии (нарастание титров антител в 4 и более раз).
Для того чтобы оценить динамику изменений титров антител различных
классов, в клинике часто используют метод парных сывороток,
т. е. производят повторное определение антител с интервалом 2-3 недели.
На основании сравнения результатов при первом и втором обследовании
делают заключение о характере и стадии заболевания (таблица 1).
Таблица 1
Серологическое определение стадии заболеванияСтадия заболевания
Определяемые
антитела
Динамика тигров антител
Острая IgM, IgG, IgA
Быстрое изменение (нарастание
более чем в 4 раза)
Хроническая IgG, IgA Титры постоянные
Реактивация / реинфекция IgO, IgA
Быстрое изменение (нарастание
более чем в 4 раза)
В настоящее время сделаны попытки определения местных секреторных
антител к С. trachomatis в цервикальных секретах, однако вывод о
диагностическом их значении следует делать с большой осторожностью.
Следует отметить, что даже в условиях, когда лаборатория работает
квалифицированно, результат исследования зависит от того, как был взят
материал, как он хранился, ставятся ли одновременно необходимые кон-
троли, исключающие неправильно взятые пробы. Приводим таблицу,
удачно систематизирующую достоинства и недостатки методов обнаружения
С. trachomatis (таблица 2).
Таблица 2
Достоинства и недостатки различных методов обнаружения
С. trachomatis
(Taylor-Robinson D. and Thomas В. I., 1991)
ПИФ Культура
клеток
ИФА ПЦР
Участки тела,
которые можно
обследовать
Любые Большинство Ограничения из-
за неспецифичности
реакций
Любые
Значение правильности
взятия
проб
Решающее Решающее Решающее Решающее
Условия транспортировки
проб
Если препарат
фиксирован, условия
не важны
Быстрая доставка
или хранение
при низкой температуре
Не имеет значения,
если проба
взята в буферный
раствор
Быстрая доставка или
хранение при низкой
температуре. Менее
важны, чем для культуры
клеток
Условия хранения
На короткое время
— при +4, на
длительное —
при-20°С
+4 С — сутки
Длительное
хранение в жидком
азоте
3-5 дней при
+4 С. Замораживание
снижает
чувствительность.
На короткое время —
при +4 С, на длительное
— в жидком азоте
Проверка адекватности
взятия
материала
Мазки оценивают
во время тестирования
Не практикуется Не практикуется Определяется, присутствует
ли ДНК
Потребность в
специальном
оборудовании
Люминесцентный
микроскоп
Центрифуга,
люминесцентный
микроскоп,
термостат
Комплект для
ИФА
Амплификатор, оборудование
для электрофореза
и др., для
ПЦР-анализа
Обработка проб Простая Трудоемкая Становится
проще для новых
тестов
Требует строгой предосторожности,
чтобы
не контаминировать
ДНК.
Чтение теста Субъективное и
утомительное
Субъективное,
умеренно утомительное
Объективное,
простое
Объективное, простое
Время выполнения
30 минут 12-72 часа 3 часа 12-24 часа
Способы проверки
результата
Повторный просмотр
Повторный просмотр
Повторение теста
Повторная проба или
переваривание эндо-
нуклеазой
Результат зависит
от
Опыта микроско-
писта
Чувствительности
клеточной
культуры
Присущей мощности
теста
Хорошего контроля и
отсутствия контаминации
Использование
как контроля лечения
Ограничено Рекомендуется Ограничено Не практикуется
Способность к
поддержанию
штамма
Нет Да Нет Нет
Изложенное позволяет сделать следующее заключение о лабораторных
методах диагностики генитального хламидиоза: надежными способами
установления диагноза являются те, которые направлены на выявление
возбудителя, его антигенов или генома. Серологические методы
следует считать вспомогательными.
ЗАБОЛЕВАНИЯ ХЛАМИДИЙНОЙ ЭТИОЛОГИИ
|